南京大学黄小强团队JACS/Angew：光酶催化不对称生物合成领域的最新进展

生物合成是提升“新质生产力”的重要手段之一，受到了学术界和工业界的广泛关注，同时也是大国竞争的重点领域之一。相对于化学合成，生物合成能制造的产品有限，但是这也为我们带来了更多的机遇。限制生物合成范畴的关键因素之一是“酶元件”的催化功能相对有限。南京大学黄小强课题组长期致力于开发新型光酶元件和光生物合成体系，前期发展了首例焦磷酸硫胺素依赖的自由基酰基转移酶（Nature 2024, 625, 74, 点击阅读详细），以及可见光直接激发的黄素依赖蛋白（Nat. Catal. 2023, 6, 996, 点击阅读详细）。近期，该课题组联合南京大学张艳课题组和厦门大学王斌举课题组，进一步在光酶催化不对称生物合成领域取得新进展，相关成果发表于J. Am. Chem. Soc. ^[1] 以及 Angew. Chem. Int. Ed. ^[2]。

南京大学黄小强课题组合影

引入有机光化学反应机制，将天然存在的非光酶“重塑”为新型的光酶，能够开发全新的非天然生物催化转化、互补当前化学合成手段。利用这个策略，领域的前期工作主要集中在黄素依赖蛋白和酮还原酶（图1-1A）。黄小强团队近期成功将天然的亚胺还原酶（imine reductase, IRED）重新设计为一类新的光酶元件（图1-1B），实现了一例光酶催化手性胺生物合成新路径。^[1]

亚胺还原酶在天然反应中通过双电子氢负转移的机制实现羰基化合物和胺的还原胺化。在本篇工作中，研究团队首次利用可见光直接激发与底物结合的亚胺还原酶，通过光引发的单电子转移过程产生活性的自由基物种；同时通过工程化改造亚胺还原酶，有效调控后续自由基转化的化学选择性和立体选择性；最终完成手性胺化合物的立体选择性合成，实现了挑战性的烯酰胺的对映选择性自由基氢烷基化。

图1-1. 新光酶体系的设计思路

作者选取烯酰胺底物1a和由苄胺衍生的吡啶盐2a作为模板底物，在测试了实验室已有的亚胺还原酶酶库后，发现IRED1能够以53%的产率、87%的ee值得到产物。为提高反应收率和立体选择性，作者通过对IRED进行工程化改造，成功得到新的单突变体IRED1-T123F能够以75%的产率以及98%的ee值催化模板反应。控制实验表明，NADPH、酶和光照都是该催化体系的必不可少的关键因素（图1-2）。

图1-2. 光-亚胺还原酶催化模板反应的控制实验

在筛选到最优的突变体后，作者对该催化体系的底物耐受性进行了考察。结果表明，该催化体系具有良好的底物适用范围和官能团耐受性（图1-3）。各种电性、邻间对位置取代，以及杂环等烯酰胺底物都能够顺利发生反应。胺、羧酸以及卤代物由于其广泛存在于自然界中，因此常被用作各种偶联反应的底物。在本篇研究中，基于亚胺还原酶的新光酶催化体系能够广泛适用于以上类型的自由基前体，并且都能以高选择性得到相应的产物，是现下光酶催化领域中底物范围最广的报道之一（45例，ee值普遍高于94%）。

图1-3. 光-亚胺还原酶催化体系底物考察

随后作者结合干湿实验，对反应机理进行了探究。通过紫外-可见光吸收实验、自由基捕获实验、氘代实验、控制实验和详细的理论计算研究，作者提出了可行的催化机理：NADPH-酶与底物生成吸光EDA物种，随后在光照下发生单电子转移生成烷基自由基，自由基对底物烯酰胺加成形成新的苄位自由基，最后在活性位点发生立体控制的氢原子转移（HAT）得到对应的手性胺化合物（图1-4）。

图1-4. 光-亚胺还原酶催化的机理推测

另一方面，黄小强团队延续课题组之前开发的可见光直接激发烯烃还原酶（ene reductase, ER）的策略（Nat. Catal. 2023, 6, 996, 点击阅读详细），进一步实现了一例光酶催化内酯化转化 ^[2]。针对ER催化机理中初始自由基成键步骤的立体化学控制难的问题，该团队通过可见光引发的单电子氧化策略以及对烯烃还原酶的进化改造，精准调控自由基C-O键形成和HAT步骤，实现含有相邻立体中心的内酯类化合物的不对称光酶催化合成（图2-1）。

图2-1. 光直接激发烯烃还原酶设计思路

作者通过聚焦理性迭代位点特异性突变（FRISM）策略进行定向进化，经过点突变和三轮迭代组合突变，获得最佳突变体ER-M5，能以57%的收率，95%的ee值和7.3:1 d.r. 值催化模板反应。控制实验表明，酶、光敏剂Rh6G和光照是该催化体系必不可少的关键因素（图2-2）。

图2-2. 反应设计、控制实验及定向进化。

该体系的底物耐受性考察结果表明，带有给电子和吸电子基团、邻位和对位取代以及杂环的芳香烯酸衍生物都能顺利发生反应 (19例，高达86%产率, 99% ee, 7.5:1 d.r.)。同时，作者进一步实现了更具挑战性的分子间双C-O和C-C键的形成 (8例，产率高达95%，96% ee, 12.9:1 d.r.)（图2-3）。

随后，该团队通过自由基捕获、脱辅因子蛋白催化、初始反应速率测定和氘代实验，验证了所提出的自由基阳离子加成→分子内亲核进攻→质子转移→氢原子转移途径。作者进一步借助了密度泛函理论（DFT）、分子动力学模拟（MD）以及量子力学/分子力学（QM/MM）等计算方法，阐明了突变体对产物立体选择性控制的可能机制。

图2-3.代表性底物

总之，南京大学黄小强课题组与厦门大学王斌举课题组合作，将亚胺还原酶重塑为新光酶，实现了新光酶元件的开发以及手性胺的模块化不对称生物合成；与南京大学张艳课题组、厦门大学王斌举课题组合作，通过重塑烯烃还原酶，成功合成一系列含有相邻立体中心的手性内酯类化合物。

工作得到了南京大学启动经费、科技部重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省自然科学基金和等项目的支持。

1. 原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Modular Access to Chiral Amines via Imine Reductase-Based Photoenzymatic Catalysis

Bin Chen, Renjie Li, Jianqiang Feng, Beibei Zhao, Jiawei Zhang, Jinhai Yu, Yuanyuan Xu, Zhongqiu Xing, Yue Zhao, Binju Wang*, and Xiaoqiang Huang*

J. Am. Chem. Soc., 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c03879

2. 原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Repurposing Visible-Light-Excited Ene-Reductases for Diastereo- and Enantioselective Lactones Synthesis

Jinhai Yu, Qiaoyu Zhang, Beibei Zhao, Tianhang Wang, Yu Zheng, Binju Wang, Yan Zhang, Xiaoqiang Huang

Angew. Chem. Int. Ed., 2024, DOI: 10.1002/anie.202402673

通讯作者简介

黄小强博士，南京大学化学化工学院特聘研究员、国家青年人才（海外）、重点研发计划青年首席；已在Nature(2), Nat. Catal.(3), Nat. Commun., JACS, ACIE, Acc. Chem. Res.(2)等杂志发表一作/通讯论文多篇。实验室正在招聘生物合成和化学合成方向的博士后、研究生，详见课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/huang_xiaoqiang